慢病毒整合位點(diǎn)標準品的應用現狀與創(chuàng )新
發(fā)布時(shí)間:2025/07/29分類(lèi):技術(shù)文章來(lái)源:科佰生物
在 CAR-T 細胞療法等基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體的整合位點(diǎn)檢測是保障臨床安全的關(guān)鍵環(huán)節。慢病毒載體在將治療性基因導入細胞時(shí)，可能隨機整合到宿主基因組中，存在插入突變風(fēng)險，若整合到原癌基因附近，可能誘發(fā)細胞惡性轉化；若整合到抑癌基因內，可能導致其功能失活。因此，FDA、CDE 等監管機構明確要求對慢病毒整合位點(diǎn)進(jìn)行精準檢測與風(fēng)險評估。
慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法
目前檢測慢病毒整合位點(diǎn)的主要平臺為高深度測序（NGS)。
Table 1. 主流的慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法比較
標準化的整合位點(diǎn)標準品不僅能校準檢測方法的靈敏度與準確性，還能為不同實(shí)驗室的數據比對、方法驗證提供“通用標尺”。在進(jìn)行方法學(xué)開(kāi)發(fā)、性能驗證、試劑盒開(kāi)發(fā)、日常檢測質(zhì)控中都需要使用標準品。
NIBSC WHO標準品（18/144）
目前商業(yè)化常見(jiàn)的慢病毒整合位點(diǎn)標準品為NIBSC WHO 標準品（18/144），它由NIBSC制備并發(fā)起，聯(lián)合全球13個(gè)國家的31家實(shí)驗室檢測的結果，確定該標準品包含共計10個(gè)慢病毒已知整合位點(diǎn)，分布在10條不同的染色體上，該產(chǎn)品面世以來(lái)已被眾多國內外檢測機構用于慢病毒整合位點(diǎn)檢測項目的性能驗證及臨床檢測應用中的質(zhì)控。盡管如此該產(chǎn)品在實(shí)際應用過(guò)程中仍存在一些短板和痛點(diǎn),其中包括：
1
該產(chǎn)品選取公布的位點(diǎn)信息僅來(lái)自于31家實(shí)驗室大多數獲得的較為一致的結果，不排除有一些潛在的未被公布，對一些復雜的非典型的整合和插入方式（例如一端或部分LTR發(fā)生缺失的整合位點(diǎn)）可能存在漏報；
2
該產(chǎn)品的參數來(lái)自于多家檢測機構檢測結果的綜合和篩選，方法學(xué)上并未明確和統一，也并未就相應的位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行驗證性實(shí)驗；
3
該產(chǎn)品只公布了整合位點(diǎn)的染色體位置，而沒(méi)有明確插入位置兩端的確切拼接序列，沒(méi)有完整精確呈現各位點(diǎn)的插入情況；
4
該產(chǎn)品并未提供整合位點(diǎn)的位點(diǎn)頻率數據，只能作為定性參考品使用，不能直接用于準確性，精密度，檢測下限等相關(guān)性能驗證；
5
該產(chǎn)品經(jīng)我們驗證是來(lái)自于一個(gè)單克隆的核酸樣本，而目前臨床上需要檢測整合位點(diǎn)的CAR-T樣本多為多克隆樣本。單克隆與多克隆樣本相比存在整合位點(diǎn)較為單一，位點(diǎn)頻率較高容易檢出等特點(diǎn)，因此對應臨床上大量多克隆樣品，整合位點(diǎn)繁多且低頻的特點(diǎn)，該產(chǎn)品并不能很好的模擬實(shí)際樣本的檢測。
科佰生物自主開(kāi)發(fā)
針對上述痛點(diǎn)和缺陷，科佰生物自主開(kāi)發(fā)了新一代的慢病毒整合位點(diǎn)標準品，該產(chǎn)品通過(guò)整合關(guān)聯(lián)擴增技術(shù)（IAA）以及常用的靶向捕獲技術(shù)和LAM-PCR三種方式結合NGS發(fā)現并驗證標準品的整合位點(diǎn)，最大程度地保證了標準品中所有整合位點(diǎn)的準確完整報道，進(jìn)一步結合了一代（Sanger）測序和數字PCR，精確定性和定量了所有整合位點(diǎn)的序列及頻率信息，做到了五重驗證。
另外為了進(jìn)一步滿(mǎn)足CAR-T細胞整合位點(diǎn)的臨床檢測需求，模擬臨床的實(shí)際情況。我們采用了T細胞來(lái)源的細胞系制備該標準品，并且除了單克隆樣品，還制備了特定低頻（位點(diǎn)頻率低至2%）的多克隆樣本，且包含位點(diǎn)更多，覆蓋的染色體條數和區域更廣，可直接用于檢測方法的性能驗證，確定方法精密度，準確性，檢測限等指標，也更貼合臨床檢測中的實(shí)際情況。
兩種標準品的對比分析
科佰生物產(chǎn)品特點(diǎn)
1
高度模擬臨床樣本
T細胞來(lái)源系作為宿主，更貼近CAR-T治療的實(shí)際場(chǎng)景。通過(guò)單克隆+多克隆標準品的設置，模擬隨機整合和多克隆多位點(diǎn)低頻的復雜性。
2
多重技術(shù)驗證體系
五步正交驗證（NGS（整合關(guān)聯(lián)擴增技術(shù)（IAA，靶向捕獲， LAM-PCR）+ Sanger確認 + dPCR定量），確保位點(diǎn)序列與頻率的準確性。在驗證LTR整合基因組位點(diǎn)的基礎上，進(jìn)一步驗證了載體上其他基因序列在基因組上的非典型整合位點(diǎn)。
3
靈活的頻率梯度設計
可提供 5%和2%低頻整合樣本，滿(mǎn)足FDA對插入突變風(fēng)險評估的靈敏度需求。
4
標準化與可擴展性
單克隆樣本可作為“標準模塊”，按需混合生成多克隆標準品，適應不同檢測需求。
慢病毒整合位點(diǎn)標準品
針對這一要求，科佰生物推出多款慢病毒整合位點(diǎn)標準品。
| 貨號 | 名稱(chēng) |
|
Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard |
|
| CBPL0003 |
Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard II (Single site) |
| CBPL0005 |
慢病毒整合位點(diǎn)分析參考試劑IV (含有性染色體插入) |
| CBPL0006 |
慢病毒整合位點(diǎn)分析陰性參考試劑 |
| CBPL0007 |
慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-5% |
| CBPL0008 |
慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-2% |
Fig1.CBPL0007 慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-5%五步正交驗證結果
Fig 2. Results of CBPL0002 by NGS (Probe capture method).
Fig 3.Results of CBPL0002 by Sanger sequencing.
Fig 4.Results of CBPL0002 by ddPCR.
