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DDPCR檢測

產(chǎn)品描述
周期報價(jià)
案例展示

服務(wù)原理

研究PCR技術(shù)從1983年開(kāi)始依次經(jīng)歷普通PCR,Real-Time PCR和dPCR,現如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣,發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例,討論dPCR技術(shù)。

什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征?有哪些方面的應用?
DdPCR全稱(chēng)Droplet Digital PCR,引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



從基本原理我們不難看出,DdPCR最大的優(yōu)點(diǎn)是絕對定量,表現為:

· 絕對定量 -ddPCR技術(shù)無(wú)需輸入標準曲線(xiàn)即可提供每個(gè)輸入樣品的目標DNA拷貝的絕對計數,使該技術(shù)非常適合目標DNA的測量,病毒載量分析和微生物定量;
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數的微小差異;
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景,有效富集靶標陽(yáng)性分區中的模板濃度,從而可以靈敏地檢測稀有靶標,并實(shí)現±10%的定量精度,靈敏度可達單個(gè)核酸分子,檢測限低至0.001%;
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴(lài)性,降低了錯誤率,可檢測到小的(1.2倍)差異,這里需要指出的是;
· 降低了耗材成本 -反應體積在皮升至納升的范圍內,減少了試劑的使用和每個(gè)數據點(diǎn)所需的樣品量,對于珍貴的樣品尤其適用;
· 降低設備成本 -基于乳液的反應系統意味著(zhù)PCR反應可以在標準的熱循環(huán)儀中進(jìn)行,而無(wú)需復雜的芯片或微流體。
· 出色的分區 -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個(gè)液滴,在96孔板上可進(jìn)行近200萬(wàn)個(gè)分區PCR反應,分區數量越多,精度越高。

服務(wù)應用

DdPCR技術(shù)有很多方面的應用,我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域,可以簡(jiǎn)單劃分為:



結合腫瘤領(lǐng)域,我們一般與之相關(guān)的有4個(gè)領(lǐng)域的應用:
1. 檢測Gene Expression,主要是檢測mRNA的定量分析;
2. 檢測Mutation(SNV和Indel),可以檢測拷貝數,也可以檢測比率;
3. 檢測CNV(拷貝數變異分析),相對定量;
4. 檢測Fusion,可以檢測拷貝數,也可以檢測比率;

案例展示

 同樣的,科佰生物也針對這4個(gè)應用開(kāi)發(fā)對應的檢測試劑盒,配套科佰生物的參考品,對試劑盒做性能評價(jià),如下我們以EGFR T790M為例
實(shí)驗一:靈敏度測試

待測樣本:不同%AF的EGFR T790M的標準品,依次為5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%。

首先我們選擇50%的EGFR T790M標準品(CBP10402),該標準品是通過(guò)基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過(guò)理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗證,確認為50%的頻率。然后使用對應的host cell的gDNA,按照質(zhì)量比(Qubit 3.0 三次定量取平均)有限稀釋到5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,每個(gè)樣本準備3個(gè)重復,合計18個(gè)樣本同一次實(shí)驗檢測對應的頻率。


對應的數據為:


由以上數據可見(jiàn),EGFR T790M檢測體系,對于0.1%都是能檢出,且符合標準,但是波動(dòng)比較大。另外實(shí)驗過(guò)程中,我們發(fā)現雖然DdPCR理論上可以生成20000個(gè)液滴,但是多次實(shí)驗表明,實(shí)際生成往往是低于這個(gè)數值,平均約為8000-10000個(gè),液滴數越少,因此低于0.1%的頻率可能會(huì )波動(dòng)很大,影響真實(shí)值判斷。

實(shí)驗二:重復性測試

待測樣本:取1%和0.1%的EGFR T790M的標準品,分成8份,每份上樣10ng,一次實(shí)驗完成對應的定標。

對應的數據為:



由以上數據可見(jiàn),EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的,全部能檢出。

同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開(kāi)發(fā)了部分DdPCR試劑盒,利用科佰特有的標準品產(chǎn)品,我們做了性能評價(jià),陸續上線(xiàn)了多款產(chǎn)品,如下是我們已經(jīng)上線(xiàn)的DdPCR探針、引物的清單,全部在QX200上驗證過(guò):


更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開(kāi)發(fā)定制,我們不僅可以開(kāi)發(fā)定制探針、引物,我們還有標準品用于驗證體系性能評價(jià)。 

同樣的,科佰生物也針對這4個(gè)應用開(kāi)發(fā)對應的檢測試劑盒,配套科佰生物的參考品,對試劑盒做性能評價(jià),如下我們以EGFR T790M為例:
實(shí)驗一:靈敏度測試

待測樣本:不同%AF的EGFR T790M的標準品,依次為5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%。

首先我們選擇50%的EGFR T790M標準品(CBP10402),該標準品是通過(guò)基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過(guò)理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗證,確認為50%的頻率。然后使用對應的host cell的gDNA,按照質(zhì)量比(Qubit 3.0 三次定量取平均)有限稀釋到5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,每個(gè)樣本準備3個(gè)重復,合計18個(gè)樣本同一次實(shí)驗檢測對應的頻率。


對應的數據為:


由以上數據可見(jiàn),EGFR T790M檢測體系,對于0.1%都是能檢出,且符合標準,但是波動(dòng)比較大。另外實(shí)驗過(guò)程中,我們發(fā)現雖然DdPCR理論上可以生成20000個(gè)液滴,但是多次實(shí)驗表明,實(shí)際生成往往是低于這個(gè)數值,平均約為8000-10000個(gè),液滴數越少,因此低于0.1%的頻率可能會(huì )波動(dòng)很大,影響真實(shí)值判斷。

實(shí)驗二:重復性測試
待測樣本:取1%和0.1%的EGFR T790M的標準品,分成8份,每份上樣10ng,一次實(shí)驗完成對應的定標。


對應的數據為:


由以上數據可見(jiàn),EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的,全部能檢出。

同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開(kāi)發(fā)了部分DdPCR試劑盒,利用科佰特有的標準品產(chǎn)品,我們做了性能評價(jià),陸續上線(xiàn)了多款產(chǎn)品,如下是我們已經(jīng)上線(xiàn)的DdPCR探針、引物的清單,全部在QX200上驗證過(guò):



更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開(kāi)發(fā)定制,我們不僅可以開(kāi)發(fā)定制探針、引物,我們還有標準品用于驗證體系性能評價(jià)。

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