慢病毒整合穩定細胞株
▏ 名詞定義
慢病毒：慢病毒是一種逆轉錄病毒，屬于逆轉錄病毒科。慢病毒表達逆轉錄酶和整合酶，前者將病毒RNA轉化為雙鏈DNA，后者將病毒DNA插入宿主DNA，會(huì )隨宿主細胞一起分裂。這一特性可用于將各種基因、突變或治療藥物穩定地遞送到細胞中，幾十年來(lái)已在研究界得到廣泛應用。一般認為，逆轉錄病毒只感染分裂細胞，而慢病毒則同時(shí)感染分裂細胞和非分裂細胞。
野生型慢病毒已被改造成可在實(shí)驗室環(huán)境中安全使用的慢病毒載體。這些改造的慢病毒載體具有諸多優(yōu)勢，使其成為多種細胞類(lèi)型和模型中有用的研究工具。慢病毒載體可以靶向非分裂細胞，能夠在宿主細胞中長(cháng)期穩定表達，并且具有較低的免疫原性。
慢病毒載體： 慢病毒的完整基因組通常8-10kb，由單鏈RNA編碼，包含諸多元件，但是實(shí)驗用于包裝的慢病毒，出于安全性的考慮，許多元件都被突變、移除。
圖1 慢病毒的完整基因組元件圖示
1. 包裝基因包含：gag、pol、env
2. 調控基因包含：tat、rev
3. 輔助基因包含：vif、vpr、vpu、nef
|
Transfer plasmid |
LTR |
in cis |
Long terminal repeat; comprised of a U3-R-U5 structure and are found on each side of the provirus. The U3 (unique 3’) contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. R is the repeat region. |
|
U3 |
in cis |
Unique 3’; contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. Removal of this region in the 3’ LTR in third-generation plasmids creates self-inactivating viral vectors. |
|
|
R |
in cis |
Repeat region where Tat binds. |
|
|
TAR |
in cis |
Trans-activating response element; found in the R region and acts as the binding site for Tat. |
|
|
U5 |
in cis |
Unique 5'; in third-generation plasmids, this region is often removed in 5’ LTRs and replaced with a heterologous promoter (CMV or RSV). |
|
|
5' LTR |
in cis |
Acts as an RNA pol II promoter; the transcript begins, by definition, at the beginning of R, is capped, and proceeds through U5 and the rest of the provirus. Third-generation plasmids use a hybrid 5' LTR with a constitutive promoter such as CMV or RSV. |
|
|
3' LTR |
in cis |
Terminates transcription started by 5' LTR by the addition of a polyA tract just after the R sequence. |
|
|
WPRE |
in cis |
Woodchuck hepatitis virus post‐transcriptional regulatory element; stimulates the expression of transgenes via increased nuclear export. |
|
|
RRE |
in cis |
Rev Response Element; he sequence to which the Rev protein binds. |
|
|
Psi (?) |
in cis |
RNA packaging signal; recognized by nucleocapsid proteins and essential for efficient viral packaging. |
|
|
cPPT |
in cis |
Central polypurine tract; recognition site for proviral DNA synthesis. Increases transduction efficiency and transgene expression. |
|
|
Packaging plasmid |
gag |
in trans |
Precursor structural protein of the lentiviral particle containing matrix, capsid, and nucleocapsid components. |
|
pol |
in trans |
Precursor protein containing reverse transcriptase and integrase components. |
|
|
rev |
in trans |
Binds to the Rev Response Element (RRE) within unspliced and partially spliced transcripts to facilitate nuclear export. Provided by a separate plasmid from gag/pol in third-generation packaging plasmids. |
|
|
tat |
in trans |
Trans-activator; binds TAR to activate transcription from the LTR promoter. Only in first- and second-generation lentiviral plasmids. |
|
|
Envelope plasmid |
env |
in trans |
The viral envelope gene; typically vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G), an envelope protein with broad tropism used to pseudotype most lentiviral vectors. |
▏ 慢病毒載體的演變
第一代質(zhì)粒包括（圖2）：
圖2 第一代慢病毒質(zhì)粒系統
第一代慢病毒質(zhì)粒缺乏安全性改進(jìn)以及無(wú)法生產(chǎn)具有復制能力的慢病毒（即產(chǎn)生能夠感染細胞并進(jìn)一步自我復制的病毒顆粒），基本已經(jīng)廢棄使用了。
第二代質(zhì)粒包括（圖3）：
1.轉移質(zhì)粒——含有轉基因和野生型 LTR
2.包裝質(zhì)粒— 包含gag、pol、tat和rev
3.包膜質(zhì)粒— 含有env
圖3 第二代慢病毒質(zhì)粒系統
圖4 第三代慢病毒質(zhì)粒系統
大多數第三代轉移質(zhì)粒也含有3' LTR的缺失，使其具有自失活性（SIN）。該缺失在一輪逆轉錄后轉移到5' LTR，從而抑制病毒整合到宿主基因組后全長(cháng)病毒的轉錄。這種情況在第二代轉移質(zhì)粒中也常見(jiàn)。
第四代質(zhì)粒包括（圖5）：
圖5 第四代慢病毒質(zhì)粒系統
第四代包裝系統針對病毒產(chǎn)量、易用性和安全性進(jìn)行了優(yōu)化。首先系統采用了四環(huán)素（Tet系統啟動(dòng)子）轉錄激活表達，其次同樣也采用了Tat反式激活因子驅動(dòng)病毒的必需成份的高表達，第三gap-pro和vpr-pol被分離到兩個(gè)質(zhì)粒上，這次生產(chǎn)復制型慢病毒需要三次低頻重組，更安全。而滴度，有報道稱(chēng)，可以達到5*10e8 IFU/mL(未濃縮上清)。
綜上，經(jīng)過(guò)歷代的慢病毒載體的演變升級，現有的第四代包裝系統成為主流的實(shí)驗室慢病毒包裝系統，不管是安全性，還是產(chǎn)量，都是比較有保障的。
▏ 包裝的宿主細胞
圖6 慢病毒包裝圖示
▏ 純化和濃縮
▏ 滴度的檢測
圖7 慢病毒包裝上清液中存在的產(chǎn)物。物理方法可以測量上清液中釋放的功能性和非功能性顆粒，以及游離衣殼蛋白（例如 p24）。功能性滴定方法專(zhuān)門(mén)測量功能性病毒顆粒。
▏ 感染靶點(diǎn)細胞
慢病毒（LV）是一種有包膜的病毒，最常見(jiàn)的是VSV-G，它通過(guò)與特定的細胞表面蛋白（比如LDLR）結合，隨后進(jìn)行膜融合進(jìn)入細胞，將含有其遺傳信息的病毒RNA注入細胞質(zhì)。這種單鏈病毒RNA通過(guò)逆轉錄轉化為DNA。病毒DNA進(jìn)入細胞核，并通過(guò)病毒整合酶整合到宿主細胞基因組中。
圖8 慢病毒整合宿主基因組的圖示
▏ 實(shí)驗中的關(guān)鍵考慮因素
▏ 穩定細胞株構建服務(wù)
科佰生物提供“慢病毒整合系統”穩定細胞株構建服務(wù)，利用該系統，我們已經(jīng)成功構建超過(guò)900株穩定細胞株的模型，有著(zhù)豐富的經(jīng)驗，歡迎溝通咨詢(xún)。
|
|
質(zhì)粒轉染 |
病毒感染 |
Flp-FRT系統 |
轉座子系統 |
基因編輯 |
||
|
脂質(zhì)體 |
電轉 |
慢病毒 |
|||||
|
適用細胞 |
部分細胞 |
幾乎所有細胞 |
幾乎所有細胞 |
內部4種細胞 |
幾乎所有細胞 |
部分細胞 |
|
|
轉染/感染效率 |
低 |
中 |
高 |
高 |
高 |
低 |
|
|
隨機整合 |
是 |
是 |
是 |
否 |
- |
否 |
|
|
生物安全等級 |
BL1 |
BL1 |
BL2 |
BL1 |
BL1 |
BL1 |
|
|
基因裝載能力 |
- |
- |
<4-5k |
- |
- |
- |
|
|
陽(yáng)性率 |
低 |
高 |
高 |
高 |
高 |
低 |
|
|
周期 |
基因合成 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
|
病毒包裝 |
- |
- |
1周 |
- |
- |
- |
|
|
混合克隆篩選 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
|
|
單克隆篩選 |
>3 周 |
>3 周 |
>3 周 |
可選 |
可選 |
>3 周 |
|
|
合計 |
> 8-10 周 |
> 8-10 周 |
>9-11周 |
5-7 周 |
5-7 周 |
> 8-10 周 |
|
|
工作負荷 |
高 |
中 |
中 |
低 |
低 |
高 |
|
