質(zhì)粒電轉整合穩定細胞株
▏ 名詞定義
電穿孔，也稱(chēng)為電通透化，是一種高效的非病毒遞送系統，可使遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）、蛋白質(zhì)、藥物或其他分子進(jìn)入細胞。它利用精確的脈沖電流在細胞膜上制造臨時(shí)孔隙，使分子能夠通過(guò)。
一旦質(zhì)粒DNA進(jìn)入細胞，就可能作用于細胞。遺傳物質(zhì)可能保持獨立（以質(zhì)粒的形式，未整合），也可能根據后續實(shí)驗步驟整合到宿主基因組中。
▏ 工作原理
體外電穿孔時(shí)，將靶細胞懸浮液與待導入細胞的質(zhì)粒DNA在導電溶液中混合，然后放入比色皿中（圖1）。電穿孔比色皿的樣品室兩側各有一塊金屬板，電流可以通過(guò)混合物。將比色皿放入電穿孔儀的腔室中，該腔室配有相應的電觸點(diǎn)，使比色皿形成電路。電穿孔儀上的控制器允許用戶(hù)設置待輸送電脈沖的電壓、波形和持續時(shí)間，這些參數應根據靶細胞類(lèi)型進(jìn)行優(yōu)化。然后，電脈沖通過(guò)樣品室。
圖 1：裝有比色皿的電穿孔儀主要部件示意圖。圖片來(lái)源：Richard Wheeler
電脈沖擾亂細胞膜的磷脂雙層，從而形成孔隙（圖 2）。這種過(guò)程是不對稱(chēng)的，孔隙首先在細胞的陽(yáng)極側形成。同時(shí)，跨膜電位增加。這驅使帶電分子（例如質(zhì)粒DNA）首先吸附到細胞陰極側的膜上，然后穿過(guò)這些孔隙進(jìn)入細胞 （圖 3）。
圖2：電穿孔過(guò)程中細胞膜破壞和孔隙形成的示意圖。圖片來(lái)源：Technology Networks。
▏ 優(yōu)缺點(diǎn)
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優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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操作相對簡(jiǎn)單 |
需要專(zhuān)用儀器 |
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對轉染難度較大的細胞類(lèi)型效果良好 |
參數必須經(jīng)過(guò)仔細優(yōu)化 |
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無(wú)載體要求，甚至不需要載體 |
對細胞損傷較大，部分無(wú)法恢復而死亡 |
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對細胞類(lèi)型的依賴(lài)性小 |
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快遞轉染大量細胞，相對成本低 |
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可以轉染含有細胞壁的物種 |
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▏ 關(guān)鍵參數
制定電穿孔方案時(shí)，重要的是選擇合適的參數，使其能夠實(shí)現通透性，同時(shí)最大程度地減少對細胞膜的干擾，以最大限度地提高細胞活力、實(shí)驗可重復性和效率。需要考慮的因素包括：
1. 波形：指數衰減脈沖、方波脈沖
方波脈沖迅速上升到設定電壓，維持該水平，然后在脈沖結束時(shí)迅速截止；指數衰減波的電壓迅速上升到目標值，然后隨時(shí)間下降。一般而言，哺乳動(dòng)物轉染選擇方波脈沖比較多；
2. 脈沖時(shí)間：針對方波脈沖，一般是直接設置持續時(shí)間；指數衰減脈沖會(huì )隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)，電壓逐漸降低，一般用時(shí)間常數TC表示，需要結合對細胞的損傷來(lái)優(yōu)化；
3. 場(chǎng)強：指施加于電極間隙的電壓，這個(gè)電壓跟很多因素有關(guān)，比如比色皿的間隙、細胞的大小、溫度等。
4. 緩沖液：緩沖液的電阻、鹽濃度、緩存能力都會(huì )影響電轉效果，比如有些敏感細胞更喜歡培養基組份；
5. 溫度：高功率一般傾向于低溫，比如冰上操作；
6. pH變化：電極電解可能引起pH變化，可以通過(guò)緩沖液調整；
7. 細胞數量：細胞過(guò)密會(huì )導致電弧放電，過(guò)稀會(huì )降低陽(yáng)性比率；
8. 細胞質(zhì)量：因為電轉本身對細胞有損傷，因此被電轉的細胞質(zhì)量尤為重要，一般是選擇健康、無(wú)污染、分裂活躍、代數低的細胞；
9. 質(zhì)粒質(zhì)量：質(zhì)量差或者污染的質(zhì)粒DNA會(huì )降低電轉效率；
其他：比色皿表面的水份、高鹽、氣泡等，都可以引起電弧放電。
▏ 瞬時(shí)表達和穩定整合
▏ 應用場(chǎng)景
1 瞬時(shí)轉染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達； 2 穩定細胞株構建，生物安全等級低，對整和效率、整合位置要求不高。
▏ 穩定細胞株構建服務(wù)
科佰生物提供“質(zhì)粒電轉整合系統”穩定細胞株構建服務(wù)，利用該系統，我們已經(jīng)成功構建超過(guò)300株穩定細胞株的模型，有著(zhù)豐富的經(jīng)驗，歡迎溝通咨詢(xún)。
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質(zhì)粒轉染 |
病毒感染 |
Flp-FRT系統 |
轉座子系統 |
基因編輯 |
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脂質(zhì)體 |
電轉 |
慢病毒 |
||||
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適用細胞 |
部分細胞 |
幾乎所有細胞 |
幾乎所有細胞 |
內部4種細胞 |
幾乎所有細胞 |
部分細胞 |
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轉染/感染效率 |
低 |
中 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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隨機整合 |
是 |
是 |
是 |
否 |
- |
否 |
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生物安全等級 |
BL1 |
BL1 |
BL2 |
BL1 |
BL1 |
BL1 |
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基因裝載能力 |
- |
- |
<4-5k |
- |
- |
- |
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陽(yáng)性率 |
低 |
高 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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周期 |
基因合成 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
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病毒包裝 |
- |
- |
1周 |
- |
- |
- |
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混合克隆篩選 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
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單克隆篩選 |
>3 周 |
>3 周 |
>3 周 |
可選 |
可選 |
>3 周 |
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合計 |
> 8-10 周 |
> 8-10 周 |
>9-11周 |
5-7 周 |
5-7 周 |
> 8-10 周 |
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工作負荷 |
高 |
中 |
中 |
低 |
低 |
高 |
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